Внук по матери протопресвитера московского Успенского собора Дмитрия Петровича Новского (1799—1879), сын окулиста Николая Васильевича Ушакова (1837—1874). Получив первоначальное домашнее образование в доме деда-священника, девяти лет, в 1882 году, поступает в подготовительный класс Первой московской шестиклассной прогимназии, а в 1889 году — в седьмой класс Пятой московской гимназии (ныне — московская школа № 91). В аттестате зрелости, выданном Ушакову в 1891 году, сказано: «За время обучения в Московской Пятой гимназии поведение его вообще было отличное, исправность в посещении и приготовлении уроков, а также в исполнении письменных работ очень хорошая и любознательность похвальная».
В 1895 году он окончил историко-филологический факультет Московского университета с дипломом 1-й степени. Первоначально занялся преподаванием в средней школе. Только в 1900—1901 годах он сдал магистерские экзамены и прочёл две пробные лекции: первая — на тему «Главные направления в изучении русского народного эпоса», вторая — на тему «Московский говор как основа русского литературного языка». С 1907 года по 1930 год Д. Н. Ушаков преподавал на кафедре русского языка Московского университета. Преподавал он также: на Высших женских педагогических курсах (1907—1918), на Высших женских курсах (1909—1919), на Высших женских курсах В. А. Полторацкой (1910—1919), в Высшей военно-педагогической школе (1919—1922), в Литературном институте им. Брюсова (1924—1925), в Государственном институте слова (1920—1925), в Редакционно-издательском институте ОГИЗа (1932—1933).
В 1903 году стал одним из организаторов Московской диалектологической комиссии, главный редактор её изданий. После смерти Ф. Е. Корша Ушаков — председатель комиссии до ликвидации её в 1931 году. К моменту работы над словарём Д. Н. Ушаков был известен своими работами по языкознанию, диалектологии, орфографии, орфоэпии, лексикографии и истории русского языка. В написанной им в 1911 году книге «Русское правописание» было проанализировано соотношение между правописанием и произношением в русской литературной речи. В этом труде Д. Н. Ушаков впервые обосновал необходимость реформы русской орфографии, а в 1917—1918 годы он стал активным участником составления проекта орфографической реформы.
Произошедшие в России в первые два десятилетия XX века революционные социальные преобразования значительно изменили словарный состав русского языка. Уже в 1920-е годы по предложению В. И. Ленина была начата работа над толковым словарём русского языка. Её как составитель и главный редактор выполнял Дмитрий Николаевич Ушаков. 4-томный «Толковый словарь русского языка» выходил с 1934 по 1940 год. На свет появился словарь, восполнивший существенный пробел в описании развития русского языка в XX веке. Этот словарь отнесён специалистами к числу обязательных в перечне словарных изданий XIX—XX веков, то есть таких, без которых картина современного русского языка будет неполной. Словарь содержит более 90 тыс. словарных статей и рассчитан на широкий круг читателей.
Дмитрий Николаевич Ушаков во время войны находился в эвакуации в Ташкенте, где он скончался 17 апреля 1942 года.
