Гвидобальдо родился в городе Пезаро (в то время — столица герцогства Урбино), в богатой и знатной семье; отец его, Раньери, получил от герцога Гвидобальдо II делла Ровере наследственный титул маркиза за военные заслуги. Учился при дворе герцога Урбино, а в 1564 году поступил в Падуанский университет, где в нём пробудился живой интерес к науке и где он подружился с поэтом Торквато Тассо. Затем юноша участвовал в военных действиях против турок-осман — в основном как военный инженер, строивший фортификационные сооружения.
По окончании кампании Гвидобальдо вернулся в родное имение — в Момбароччо (на полпути между Пезаро и Урбино) — и посвятил себя изучению различных наук (преимущественно математики, астрономии и физики). Математику и механику он изучал под руководством математика Федерико Коммандино (известного, в частности, своими переводами с греческого на латинский трудов древнегреческих математиков и механиков). В это время Гвидобальдо обрёл друга в лице Бернардино Бальди, который также был учеником Коммандино.
В 1588 году Гвидобальдо дель Монте был назначен генеральным инспектором укреплений Тосканского герцогства. Ещё раньше (около 1586 года) он обратил внимание на 22-летнего талантливого физика и математика Галилея, к этому времени — автора нескольких оригинальных книг и изобретений, но оставшегося без средств к существованию. Маркиз взял его под своё покровительство и (через посредство своего брата-кардинала) представил тосканскому герцогу Фердинанду I Медичи. Это помогло Галилею получить свою первую научную должность — кафедру в Пизанском университете. Спустя 3 года (1592) маркиз помог Галилею стать профессором Падуанского университета, где он совершил свои знаменитые телескопические открытия.
В XVI—XVII веках Гвидобальдо дель Монте пользовался большим уважением — в первую очередь как теоретик механики (хотя он занимался также математикой и астрономией). Известно, что его труды изучал Декарт. Даже в XIX веке цитаты из работ Гвидобальдо можно найти в статьях Лагранжа. В двух сочинениях Гвидобальдо дель Монте — «Книга о механике» (1577) и «Замечания по поводу трактата Архимеда “О равновесии плоских фигур”» (1588) — рассматриваются вопросы статики (прежде всего, равновесия «простых машин»). В этих работах Дель Монте, глубоко изучивший в своё время труды Архимеда, выступил как убеждённый сторонник геометрического варианта статики (и столь же убеждённый противник её кинематического варианта). В основу своей теории равновесия систем подвешенных тяжёлых тел он положил два закона: архимедов критерий расположения центра тяжести на вертикальной прямой, проходящей через точку подвеса и принцип равенства моментов сил относительно неподвижной точки рассматриваемой машины.
Дель Монте принадлежат несколько изобретений, в том числе — оригинальный чертёжный инструмент, предназначенный для вычерчивания правильных многоугольников и деления отрезка на равные части.
